O sequenciamento do DNA, definido como o processo de leitura da sequência das bases de uma molécula, abrange diversas abordagens de biotecnologia, e inclui todas as técnicas ou métodos utilizados para determinar a sequência das bases A, T, C e G em uma fita de DNA. Nos últimos anos, metodologias de sequenciamento tem se tornado fundamentais em diversos campos da biotecnologia, como por exemplo para o monitoramento do meio ambiente e microbiomas, melhoramento genético, medicina forense, e em especial, para diagnóstico clínico.
O estudo do nosso código genético tem levado ao melhor entendimento de mecanismos de doenças, da relação fenótipo x genótipo, das bases da hereditariedade e individualidades, determinando a era da medicina de precisão.
Devido à enorme aplicabilidade e relevância em tantas áreas da biotecnologia, o sequenciamento do DNA tem sido alvo de grandes pesquisas e investimentos. De fato, os avanços em relação ao desenvolvimento de sequenciamentos rápidos, baratos e confiáveis tem testemunhado uma enorme melhoria desde o lançamento do projeto genoma humano.
Uma das tecnologias de sequenciamento mais promissoras é o sequenciamento por nanoporos. Essa estratégia permite a identificação de sequências de DNA através da passagem por poros, que geram sinais específicos para identificação das bases de nucleotídeos.
O sequenciamento por nanoporos tem gerando grande interesse por diversas vertentes da biotecnologia devido ao seu baixo custo e rapidez. No entanto, alguns desafios ainda precisam ser resolvidos para que essa tecnologia se torne amplamente utilizada.
Nanoporos e o sequenciamento de terceira geração
O sequenciamento de terceira geração é utilizado para o sequenciamento de moléculas únicas, sem a necessidade de amplificação. Além disso, essa tecnologia produz leituras mais longas. Essa tecnologia permite custo reduzido e simplificação do processo, e tem tornado o sequenciamento por nanoporos a maior promessa da biotecnologia.
Para compreender a tecnologia de nanoporos, é fundamental compreender as características físicas e químicas dos poros utilizados para o sequenciamento de DNA, uma vez que o sinal gerado é referente à interação entre a fita de DNA e o nanoporo. Existem três classes de nanoporos:
- Nanoporos biológicos
Geralmente localizados em uma membrana de lipossomos, por exemplo uma bicamada lipídica, e em membranas de polímeros, sendo chamados também de canais de proteína transmembrana. Existem diversos tipos de nanoporos biológicos, e esses são altamente reprodutíveis em tamanho específico e estrutura, e pode ser facilmente alterado através de técnicas moleculares específicas. Em geral, nanoporos biológicos apresentam inúmeros benefícios em aplicações de sequenciamento de DNA como sensibilidade, flexibilidade e simplicidade. No entanto, sensores baseados em nanoporos biológicos podem ter problemas como estabilidade limitada e tamanhos restritos.
- Nanoporos de estado sólido
Basicamente, são poros em materiais sólidos eue podem ser produzidos em diversos tamanhos, e são altamente estáveis, diferente dos nanoporos biológicos. Esses nanoporos tem atraído o interesse de pesquisadores devido ao avanço em técnicas de microfabricação. Recentemente, nanoporos artificiais foram aplicados em diferentes campos de aplicação como por exemplo, diagnóstico de doenças, detecção de proteínas e sequenciamento de DNA. Os nanoporos de estado sólido trabalham bem sobre várias condições e podem ser fabricados através de procedimentos de fabricação de semicondutores. No entanto, diversos estudos têm mostrado que bases diferentes interagem de maneira similar com o canal, entra outras limitações, demonstrando que os nanoporos de estado sólido não são tão eficientes para o sequenciamento de DNA.
- Nanoporos híbridos
Para superar as limitações biológicas e artificiais dos nanoporos, diversos esforços têm sido feitos para combinar as melhores características de ambos. Assim, os nanoporos híbridos são fabricados para controlar a translocação de DNA ou proteínas, através da melhora da especificidade química ao passo em que se mantém a estabilidade química e mecânica.
Grafeno e sequenciamento de DNA: uma nova promessa
O grafeno é um material único que fornece inúmeras novas oportunidades e abordagens para o sequenciamento de DNA. Desde a sua descoberta em 2004, o interesse nesse material tem aumentando consideravelmente no campo da biotecnologia devido às suas características e inúmeras aplicabilidades possíveis.
Composto por uma monocamada de átomos de carbono ligados por padrões hexagonais repetitivos, o grafeno apresenta características únicas, como por exemplo, é extremamente fino, muito robusto, flexível, transparente, altamente condutível e pode ser produzido com baixo custo. Apresenta ainda características incríveis em relação às propriedades eletrônicas, alta estabilidade, além de ser um excelente condutor térmico e elétrico. Especialmente devido à essas características que o grafeno tem atraído muita atenção, já que é capaz de conduzir altas cargas elétricas, mesmo a temperatura ambiente.
O perfil de condutividade elétrica, a estabilidade e a espessura do grafeno instigaram pesquisadores a estudar seu potencial uso para detectar e analisar sequências de DNA, e dessa forma, foram propostas algumas possíveis abordagens de biotecnologia para utilização desse material.
- Nanoporos de grafeno para sequenciamento de DNA: Justamente pela sua espessura anatômica e estrutura íon-impermeável, o grafeno representa a membrana mais recente descrita para o sequenciamento baseado em nanoporos. Nesse modelo, cada base da molécula de DNA bloqueia a corrente iônica através de nanoporos minúsculos dessa fina camada de grafeno, de maneiras ligeiramente diferentes para cada nucleotídeo. Dessa forma, o sequenciamento por nanoporos é realizado tanto com nanoporos biológicos, como de estado sólido.
- Efeito de túnel através de nanoporos de grafeno: Nesse modelo, cada base da molécula de DNA em um nanoporo leva a uma corrente de passagem diferente (efeito de túnel), uma vez que diferentes bases têm diferentes níveis de estrutura elétrica. A ideia é mensurar a condutividade através de dois eletrodos de grafeno, e controlar a alteração da corrente quando as bases de DNA passam por esses nanoporos. Dessa forma, quando uma base diferente de DNA passa pelo alcance da voltagem dos eletrodos, uma corrente diferente é observada. Essa opção é bastante vantajosa uma vez que a película de nanoporos é o próprio eletrodo, o que resolve o problema da biotecnologia de fabricação de nanoeletrodos alinhados com os nanoporos.
- Transporte através de nanofita de grafeno com um nanoporo: As propriedades elétricas do grafeno podem ser exploradas mais diretamente para o sequenciamento de DNA pelo monitoramento da corrente por uma nanoestrutura estreita de grafeno que contém um nanoporos, através do qual uma molécula de DNA se transloca. Dependendo da conformação da estrutura de grafeno, suas priedades de semicondutor são alteradas, abrindo um leque interessante de possibilidades. Nanofitas de grafeno com nanoporos também são teoricamente capazes de detectar quando o DNA está metilado ou não, um biomarcador fundamental para o estudo da epigenética.
- Métodos de detecção baseados na adsorção do DNA: A adsorção é a forma através da qual moléculas ficam retidas em uma determinada superfície. A interação entre as nucleobases de DNA e o grafeno permitiram aos pesquisadores usar essa interação para aplicações de sequenciamento de DNA. Essa abordagem é baseada na modulação do grafeno devido à característica do DNA específica de adsorção, onde uma atração intermolecular fraca acontece abaixo da temperatura crítica, e pode resultar no desenvolvimento de uma mono ou multicamada. Assim, a adsorção do DNA em superfícies de nanoestruturas de grafeno pode auxiliar de maneira ampla na identificação das bases de DNA.
E quais são os desafios e perspectivas do sequenciamento de DNA baseado em grafeno?
Apesar do desenvolvimento promissor e dos inúmeros estudos que têm sido realizados, algumas questões em relação ao sequenciamento de DNA utilizando nanoporos permanecem em aberto. Duas das principais questões são: a alta velocidade da translocação do DNA e a possível baixa sensibilidade, uma vez que ainda há questões sobre o alcance de uma resolução de bases únicas.
O campo da biotecnologia tem demostrado um enorme entusiasmo em relação à essa nova tecnologia, e avanços sobre o processo de fabricação dos nanoporos vão permitir melhorar cada vez mais a performance e a aplicabilidade dessa tecnologia na prática.
A necessidade por técnicas de sequenciamento de DNA cada vez mais rápidas, confiáveis e de baixo custo estão aumentando. Na última década, essa terceira geração de sequenciamento de DNA utilizando nanoporos de grafeno tem sido massivamente estudada com o principal objetivo de alcançar detecção de molécula única em tempo real, para fornecer novos dispositivos de sequenciamento genômico.
Dessa forma, os nanoporos de grafeno têm um significado importante, já que precisam de uma pequena quantidade de material, sem amplificação, e permitem leituras de longos fragmentos com alto rendimento, simplificando o protocolo e permitindo seu uso em diversas aplicações a custos menores.
Hoje existem muitos estudos teóricos e algumas aplicações experimentais em relação a essa tecnologia. O fato do grafeno ser um material único que oferece oportunidades inesperadas, e da leitura do código genético ser uma necessidade cada vez maior, resultam em uma combinação de possibilidades infinitas. Sem dúvidas, os próximos anos testemunharão avanços inesperados no campo da biotecnologia, especialmente no que diz respeito ao sequenciamento de DNA de terceira geração e seu imenso leque de aplicações, trazendo avanços talvez ainda inimagináveis para a ciência e para a biotecnologia.
Referências:
- Novoselov, K. S. et al. Electric field effect in atomically thin carbon films. Science 306, 666–669 (2004)
- Steinbock, L. J. & Radenovic, A. The emergence of nanopores in next-generation sequencing. Nanotechnology 26, 074003 (2015).
- Heerema, S., Dekker, C. Graphene nanodevices for DNA sequencing. Nature Nanotech 11, 127–136 (2016)
