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O programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) foi desenvolvido para realizar buscas e comparar sequências biológicas contra um banco de dados que contém uma grande quantidade de informação, retornando sequências mais similares, referentes à sequência pesquisada.
É uma ferramenta muito utilizada dentro da bioinformática por ser muito rápida e ter diferentes variações, atendendo diversas possibilidades de busca.
Essas possibilidades de busca se relacionam a cada tipo de BLAST que é disponibilizado pela ferramenta e cada uma delas possui um objetivo específico. O uso de cada uma dessas variações vai depender do tipo de sequência de entrada utilizada e, também, do banco de dados que se deseja buscar.
Ferramentas BLAST e suas funções
Basicamente, as funções de cada uma das ferramentas do BLAST são:
- BLASTn: pesquisa uma sequência de nucleotídeo em uma base de dados de nucleotídeos, o que é útil na identificação de sequências desconhecidas obtidas de sequenciamentos e PCR. Além disso o programa busca relacionar as sequencias de forma evolutiva (busca por homologia) com a sequência de entrada e identificar genes.
- BLASTp: realiza a comparação da sequência proteína-proteína. Neste tipo de busca é necessário ter uma sequência de aminoácidos (que formam as proteínas) para comparar com sequencias já identificadas nos bancos de dados. O BLASTp também pode verificar a homologia entre sequencias, conservação de aminoácidos e diferenças pontuais que interferem na atividade final das proteínas. A sequência de entrada pode ser oriunda de experimentos em bancada como o sequenciamento ou de buscas em bancos de dados proteicos como o NCBI protein.
- BLASTx: pesquisa nucleotídeos em um banco de dados de proteínas, traduzindo a sequência de interesse em tempo real. Esta é uma ferramenta muito importante para conhecer o produto gênico quando se tem apenas dados genômicos e não se tem ciência dos produtos que são codificados pelos genes representados na sequência de interesse.
Por conta deste recurso a ferramenta auxilia também na anotação estrutural e funcional de novos genes, sendo comumente a primeira análise efetuada de dados genômicos obtidos após o sequenciamento.
- tBLASTn: pesquisa proteínas em um banco de dados de nucleotídeos, traduzindo o banco de dados em tempo real. Essa opção permite inferir quais genes ou porções do genoma estão relacionadas com uma determinada proteína, quando não se tem a sequência de nucleotídeos disponível.
- tBLASTx: a sequência de nucleotídeos será convertida em 6 sequências de aminoácidos (uma para cada fase de leitura), as quais serão comparadas com as 6 possíveis fases de leitura em um banco de dados de nucleotídeos. É a variação mais lenta do BLAST e procura contornar a potencial mudança de quadro e ambiguidades na sequência, o que pode impedir a detecção de quadros de leitura abertos. Isso é muito útil na identificação de proteínas provindas de diversos rounds de sequenciamento e novos genes.
O BLAST é uma das principais ferramentas disponíveis na plataforma NCBI e pode ser utilizado gratuitamente pelo site: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
O software é disponibilizado online e realiza alinhamentos locais entre a sequência dada pelo pesquisador com todas as sequências disponíveis no banco de dados do GenBank.
O BLAST é uma das principais ferramentas disponíveis na plataforma NCBI e pode ser utilizado gratuitamente.
O software é disponibilizado online e realiza alinhamentos locais entre a sequência dada pelo pesquisador com todas as sequências disponíveis no banco de dados do GenBank.
Como o BLAST funciona?
O algoritmo do BLAST realiza buscas baseadas em alinhamentos locais que são confiáveis e bastante rápidos. Isto faz com que o programa ofereça vantagens em relação a outras ferramentas de alinhamento.
A rápida velocidade do alinhamento está associada ao mecanismo de busca pela similaridade realizada pelo algoritmo do BLAST. A busca no BLAST foca em pequenas sequências comuns existentes entre a sequência dada e as sequências do banco de dados. Observe o exemplo:
Considere a sequência a seguir: CGTACTGCCATT.
Exemplos de sequências que poderiam ser achadas no BLAST seriam:
Sequência dada: CGTACTGCCATT
Busca 1 CGT
Busca 2 TAC
Busca 3 CCA
Busca 4 CAT
Tutorial do BLAST
Acessa o site do NCBI e clique na opção BLAST
Como acessar a ferramenta Blast?
- Acessa o site do NCBI e clique na opção BLAST
- Selecione a ferramenta da família BLAST a ser utilizada. Usaremos a exemplo o blastn.
- Informe ao programa a sequência de interesse que será analisada
A sequência pode ser informada de diferentes formas. Uma delas é inserir a mesma no campo “Enter accession number(s), gi(s), or FASTA sequence(s)”. Outra forma é fazer o upload do arquivo com a sequência no botão “Escolher arquivo”.
A sequência também pode ser inserida como um arquivo no formato FASTA. Além disso, pode ser informado o número de acesso do GenBank ou o número GI – GenInfo Identifier (identificador de informação do gene). - Atribua um título para a pesquisa realizada
Em Job Title podemos dar um título para essa pesquisa. Ainda podemos marcar a caixa no canto inferior esquerdo se quisermos realizar um alinhamento múltiplo das sequências inseridas. Para realizar o alinhamento múltiplo é necessário informar mais de uma sequência.
- Configure os parâmetros para a sequência analisada
A primeira seção (o primeiro quadro de configurações) é igual para quase todas as análises nas ferramentas do web blast, sendo adicionada a opção “Genetic Code” apenas no BLASTx e no tBLASTx. Essa função é importante para que seja selecionado o código genético que vai ser utilizado na tradução da proteína que esses métodos de pesquisa realizam.
No segundo quadro abaixo, é a seção utilizada para organizar os parâmetros do alinhamento, como o banco de dados que será usado ou os organismos que devem ser inseridos e/ou excluídos da pesquisa.
Cada ferramenta do blast apresenta opções diferentes nesta seção, ou seja, os parâmetros para uma busca de nucleotídeos serão diferentes dos parâmetros utilizados em uma busca de aminoácidos.
O BLASTn e o BLASTp apresentam mais um quadro. Nele é possível realizar a escolha do algoritmo que será usado para a pesquisa. Geralmente se utiliza a opção default para análises com estas ferramentas nesta seção.
Vale destacar que se a sequência de entrada que foi inserida no programa do Blast foi baixada anteriormente do próprio NCBI, então possivelmente a primeira amostra da lista de resultados seja a própria sequência de interesse que foi realizada a busca. Nesse caso, o resultado só passa a contar a partir da segunda sequência listada.
Interpretação de resultados
Na aba Descriptions é possível visualizar os resultados da análise realizada. As subdivisões desta aba são, em sua respectiva ordem: descrição, nome científico, nome comum, max score, total score, cobertura da query (que é a sequência de entrada), E value, porcentagem de identidade, tamanho da sequência comparada e código de acesso da sequência comparada.
Observe como o resultado é apresentado:
O BLAST permite fazer o download dos resultados obtidos em vários formatos. Pode-se selecionar através dos “checkbox” ao lado do nome da sequência quais alinhamentos vão fazer parte do arquivo baixado. Max score e total score são parâmetros complementares. Eles estão ligados com o valor obtido pelo alinhamento.
- O max score é o valor máximo que pode ser obtido naquele alinhamento, enquanto o total score é o valor obtido pelo alinhamento. Se o total score for igual ao max score significa que o alinhamento obteve o maior valor possível.
- Cobertura da query é um valor dos parâmetros do alinhamento que demonstra o quanto da sequência enviada conseguiu realizar um alinhamento. Esse valor é importante de ser analisado, uma vez que podem existir casos em que apenas um pedaço da sequência enviada seja alinhada e, por isso, os valores do alinhamento sejam bons.
- E-value é um parâmetro muito importante do alinhamento. Ele demonstra a possibilidade do alinhamento ter sido realizado ao acaso. Quanto mais próximo ao zero (0) o valor for, mais confiabilidade pode se ter no alinhamento.
- A porcentagem de identidade está relacionada com a similaridade da sequência enviada pelo usuário com a sequência alinhada, levando-se em consideração a cobertura da sequência.
É importante notar que alguns outros parâmetros somente aparecem quando o alinhamento é observado. O score é um desses parâmetros presente nessa visualização. É possível visualizar o valor de “identities”, que demonstra o número de matches do alinhamento. Um match é quando a sequência enviada e a sequência comparada possuem o mesmo nucleotídeo ou um mesmo resíduo na mesma localização.
Além disso, é possível visualizar o número de gaps (espaçamentos entre os resíduos das sequências), que são espaços adicionados pelo algoritmo do programa por não existir similaridade naquela região.
Na aba “Graphic Summary” é possível visualizar os alinhamentos gerados em forma de gráfico. Ao passar o cursor do mouse por cima de cada uma das linhas, observa-se o nome da sequência à qual a sequência inserida pelo usuário (demonstrada em cima, em azul, com o nome “Query”) foi alinhada. Existe um padrão visual, o qual mostra as linhas representando as sequências com cores diferentes, baseado no score que foi obtido no alinhamento.
Sobre o Autor:
Joanã Oliveira é estudante de biomedicina, analista de marketing na Infobio Jr e membro da liga acadêmica de ciências biomédicas.
Referências:
APOSTILA BIOINFORMÁTICA— DA BIOLOGIA À FLEXIBILIDADE MOLECULAR. E-book. 1. ed. São Paulo: UFRGS, 2014. Disponível em: https://www.ufrgs.br/bioinfo/ebook/. Acesso em: 08 jan. 2021.
BLAST. GeneBio. Disponível em: http://www.genebio.ufba.br/blast/. Acesso em 08 dez. 2021.
Ômix Data. Entendendo o Web Blast e seus resultados – parte 1. Disponível em: https://medium.com/omixdata/entendendo-blast-parte-i-conceitos-principais-4711e34cc2b6#:~:text=O%20BLAST%20ainda%20permite%20verificar,%C3%A9%20realizada%20a%20n%C3%ADvel%20proteico. Acesso em 08 dez. 2021.
Ômix Data. Entendendo o Web Blast e seus resultados – parte 1. Disponível em: https://medium.com/omixdata/entendendo-o-blast-parte-ii-o-web-blast-e-seus-resultados-3dbd5fb7d80d. Acesso em 08 dez. 2021.
Portal Educação. Como usar o BLAST. Disponível em: https://siteantigo.portaleducacao.com.br/conteudo/artigos/biologia/como-usar-o-blast/36379. Acesso em 08 dez. 2021
Aragão(2021). Biodata descomplica: Bioinformática do zero ao avançado. eBook. Disponível em: https://biodatacursos.wixsite.com/biodatacursos (Instagram: @andxi).
BLAST. NCBI. Disponível em: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. Acesso em: 08 dez. 2021.
