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Os avanços tecnológicos das últimas décadas permitiram que a citometria de fluxo ganhasse espaço dentro dos laboratórios. Com essa técnica, é possível realizar diversas análises e tarefas, como é o caso da imunofenotipagem e da separação física de células.
Quer saber mais sobre essa técnica? Neste texto, abordamos detalhes técnicos e algumas aplicações da citometria de fluxo, confira!
O que é citometria de fluxo?
A citometria de fluxo é uma técnica de análise celular utilizada por diversos campos da biologia e da medicina. Algumas das aplicações desta técnica são:
- Imunofenotipagem;
- Separação física de células;
- Análise de citocinas pró-inflamatórias e quimiocinas;
- Análise de proliferação celular;
- Morte celular;
- Análise de proteínas fluorescentes;
- Análise do ciclo celular;
- Citometria de fluxo de RNA;
- Contagem absoluta de células;
- Ensaios de fagocitose;
- Análise de microrganismos e interação célula-hospedeiro.
Um citômetro de fluxo, portanto, é um instrumento capaz de adquirir dados quantificáveis a partir de uma amostra de células. Devido a sua grande versatilidade e possibilidade de adequação do sistema aos objetivos das análises, estes equipamentos são encontrados em laboratórios de muitas áreas, como:
- Imunologia;
- Microbiologia;
- Biologia Molecular;
- Oncologia;
- Farmacologia.
Como é feita a citometria de fluxo?
A citometria de fluxo é realizada com citômetros de fluxo. Estes equipamentos empregam três sistemas: um óptico, um de fluidos e um sistema eletrônico.
O sistema de fluidos é responsável por inserir e conduzir as células em suspensão, enquanto o sistema óptico gera e capta sinais a partir de lasers, filtros e detectores.
Já o eletrônico O sistema eletrônico, por sua vez, amplifica e converte os sinais advindos dos detectores, gerando dados que podem ser analisados sob múltiplos parâmetros.
Em linhas gerais, o funcionamento deste equipamento consiste em excitar (com lasers) os fluorocromos ligados às células (ou moléculas) de interesse. A partir da difração da luz (e de propriedades como a impedância), torna-se possível adquirir dados tangíveis sobre a natureza do alvo de interesse. A figura abaixo ilustra este mecanismo.
De maneira específica, células são previamente tratadas com anticorpos marcados com fluorocromos. Estes anticorpos, então, ligam-se ao alvo de interesse e as células são submetidas a um fluxo hidrodinâmico, que se estabelece com a injeção controlada de um fluido composto por solução salina.
Durante o fluxo, a mistura de amostra com solução salina passa por uma câmara (flow cell), cujo diâmetro pode chegar a 50μm. Esse processo, chamado de foco hidrodinâmico, obriga as células a ficarem “empilhadas”, permitindo que a luz incida nelas de maneira individualizada.
Os lasers utilizados variam em composição e devem ser cuidadosamente selecionadas de acordo com o tipo de análise a ser realizada, considerando a amostra e o fluorocromo utilizado para marcar o anticorpo. Os comprimentos de onda utilizados variam entre 300nm – 500nm.
Ao passar pelos feixes de luz, a célula refrata parte dessa luz na direção e sentido do laser (Forward Scatter – FSC) e outra parte a 90º (Side Scatter – SSC); esta etapa é chamada de interrogação. Em seguida, a luz dispersa é filtrada por cores (com espelho dicróicos) e captada por dispositivos chamados de Tubos Fotomultiplicadores (PMTs).
O que a citometria de fluxo identifica?
Tradicionalmente, a citometria de fluxo identifica o tamanho e a complexidade (granulosidade) das células. Isso é realizado de acordo com os dados do Forward Scatter e do Side Scatter, respectivamente.
A partir disso, muitos outros parâmetros específicos podem ser analisados com um citômetro de fluxo, como é o caso do Cluster de Diferenciação Celular e mesmo a contagem de células em uma amostra.
As informações geradas por citômetros de fluxo são dispostas em dot-plots ou histogramas, conforme verificado no gráfico abaixo, que representa a proporção de células com/sem as proteínas de superfície CD8 e HLA-DR.
Quando utilizar a citometria de fluxo?
Dada sua versatilidade, a citometria de fluxo pode ser empregada em vários contextos. Por isso, não é possível prever uma “utilidade” principal para a técnica, ainda que ela seja o padrão escolhido para a realização de análises de imunofenotipagem e para a separação física de células (cell sorting).
Imunofenotipagem
A imunofenotipagem é uma técnica utilizada para detectar a ocorrência de determinadas reações do tipo antígeno-anticorpo. Algumas das células leucocitárias são altamente polimórficas, tornando este conjunto celular heterogêneo.
Uma das vantagens da citometria de fluxo é justamente sua capacidade multiparamétrica, tornando-a uma técnica especialmente atraente para a imunofenotipagem.
A partir Através de reações de imunofluorescência e do uso de múltiplos canais para a detecção de sinais fluorescentes, equipamentos modernos são capazes de medir até 30 parâmetros diferentes.
A imagem abaixo, obtida por Jimenez-Carretero, representa o resultado do experimento realizado com os padrões analíticos de um citômetro de fluxo equipado com 4 lasers e 18 detectores diferentes.
Avaliação do Conteúdo de DNA/ciclo celular
A avaliação do conteúdo de DNA é utilizada, por exemplo, na oncologia. Com esta metodologia, é possível observar populações celulares específicas ao longo do ciclo celular, permitindo a determinação da distribuição destas populações.
Ao realizar análises multiparamétricas, cientistas também conseguem mensurar DNA e RNA simultaneamente através de marcadores moleculares específicos. A partir das informações obtidas, é possível inferir onde, no ciclo celular, as células de uma amostra se encontram.
Além disso, é possível rearranjar o sistema de espelhos/lasers para realizar análises de proliferação celular. Neste tipo de ensaio, pesquisadores miram na análise de eventos alvo, relativos à proliferação celular, como a incorporação de análogos de timidina no DNA replicante.
Ensaios de apoptose (morte celular)
A apoptose é um evento de interesse para pesquisadores de diversas áreas, da patologia à imunologia. Este tipo de morte celular é utilizado pelo sistema imune para manter a homeostase, destruindo células sem o intermédio de reações inflamatórias.
A determinação de apoptose é realizada de maneira semelhante à avaliação do ciclo celular. Difere-se, entretanto, no tipo de marcador utilizado: aqui são utilizados marcadores moleculares associados a eventos de degradação do DNA, como é o caso do ensaio TUNEL, que mede a digestão do DNA por endonucleases.
Adicionalmente, a atividade de caspases pode ser medida a partir de colorações específicas, como de Anexina V e com Hoescht 33342.
Conclusão
A citometria de fluxo é uma técnica amplamente utilizada na biologia e na medicina. A gama de aplicações dessa técnica é grande, o que acontece em função de sua versatilidade: diferentes canais de luz, cromóforos, detectores e sistemas eletrônicos são alguns dos sistemas personalizáveis em um citômetro de fluxo.
A citometria de fluxo é realizada com a passagem de células de maneira individual sobre um feixe de luz. A luz dispersa é captada por tubos fotomultiplicadores, que transformam o sinal em dados computacionais.
Algumas de suas aplicações a serem citadas são a imunofenotipagem, a avaliação do conteúdo celular e ensaios de apoptose.
Referências
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Herold, N.C.; Mitra, P. Immunophenotyping. StatPearls Publishing, 2022.
Jimenez-Carretero, D. et al. Flow Cytometry Data Preparation Guidelines for Improved Automated Phenotypic Analysis. J Immunol. 2018
