Citometria de Fluxo: O que é e como Funciona?

A citometria de fluxo é uma técnica que utiliza um citômetro de fluxo para medir características físicas e químicas de células ou partículas. A seguir, explicamos melhor o assunto.
citometria de fluxo imagem ilustrativa do procedimento

Os avanços tecnológicos das últimas décadas permitiram que a citometria de fluxo ganhasse espaço dentro dos laboratórios. Com essa técnica, é possível realizar diversas análises e tarefas, como é o caso da imunofenotipagem e da separação física de células.

Quer saber mais sobre essa técnica? Neste texto, abordamos detalhes técnicos e algumas aplicações da citometria de fluxo, confira!

O que é citometria de fluxo?

A citometria de fluxo é uma técnica de análise celular utilizada por diversos campos da biologia e da medicina. Algumas das aplicações desta técnica são:

  • Imunofenotipagem;
  • Separação física de células;
  • Análise de citocinas pró-inflamatórias e quimiocinas;
  • Análise de proliferação celular;
  • Morte celular;
  • Análise de proteínas fluorescentes;
  • Análise do ciclo celular;
  • Citometria de fluxo de RNA;
  • Contagem absoluta de células;
  • Ensaios de fagocitose;
  • Análise de microrganismos e interação célula-hospedeiro.

Um citômetro de fluxo, portanto, é um instrumento capaz de adquirir dados quantificáveis a partir de uma amostra de células. Devido a sua grande versatilidade e possibilidade de adequação do sistema aos objetivos das análises, estes equipamentos são encontrados em laboratórios de muitas áreas, como:

  • Imunologia;
  • Microbiologia;
  • Biologia Molecular;
  • Oncologia;
  • Farmacologia.

Como é feita a citometria de fluxo?

A citometria de fluxo é realizada com citômetros de fluxo. Estes equipamentos empregam três sistemas: um óptico, um de fluidos e um sistema eletrônico.

O sistema de fluidos é responsável por inserir e conduzir as células em suspensão, enquanto o sistema óptico gera e capta sinais a partir de lasers, filtros e detectores.

Já o eletrônico O sistema eletrônico, por sua vez, amplifica e converte os sinais advindos dos detectores, gerando dados que podem ser analisados sob múltiplos parâmetros.

Em linhas gerais, o funcionamento deste equipamento consiste em excitar (com lasers) os fluorocromos ligados às células (ou moléculas) de interesse. A partir da difração da luz (e de propriedades como a impedância), torna-se possível adquirir dados tangíveis sobre a natureza do alvo de interesse. A figura abaixo ilustra este mecanismo.

citometria de fluxo - ilustração de funcionamento do sistema

De maneira específica, células são previamente tratadas com anticorpos marcados com fluorocromos. Estes anticorpos, então, ligam-se ao alvo de interesse e as células são submetidas a um fluxo hidrodinâmico, que se estabelece com a injeção controlada de um fluido composto por solução salina.

Durante o fluxo, a mistura de amostra com solução salina passa por uma câmara (flow cell), cujo diâmetro pode chegar a 50μm. Esse processo, chamado de foco hidrodinâmico, obriga as células a ficarem “empilhadas”, permitindo que a luz incida nelas de maneira individualizada.

Os lasers utilizados variam em composição e devem ser cuidadosamente selecionadas de acordo com o tipo de análise a ser realizada, considerando a amostra e o fluorocromo utilizado para marcar o anticorpo. Os comprimentos de onda utilizados variam entre 300nm – 500nm.

Ao passar pelos feixes de luz, a célula refrata parte dessa luz na direção e sentido do laser (Forward Scatter – FSC) e outra parte a 90º (Side Scatter – SSC); esta etapa é chamada de interrogação. Em seguida, a luz dispersa é filtrada por cores (com espelho dicróicos) e captada por dispositivos chamados de Tubos Fotomultiplicadores (PMTs).

O que a citometria de fluxo identifica?

Tradicionalmente, a citometria de fluxo identifica o tamanho e a complexidade (granulosidade) das células. Isso é realizado de acordo com os dados do Forward Scatter e do Side Scatter, respectivamente. 

A partir disso, muitos outros parâmetros específicos podem ser analisados com um citômetro de fluxo, como é o caso do Cluster de Diferenciação Celular e mesmo a contagem de células em uma amostra. 

As informações geradas por citômetros de fluxo são dispostas em dot-plots ou histogramas, conforme verificado no gráfico abaixo, que representa a proporção de células com/sem as proteínas de superfície CD8 e HLA-DR.

Gráfico de Dot-plots obtidos pela citometria de fluxo
Dot-plots obtidos por citometria de fluxo são divididos por quadrantes. Neste gráfico, por exemplo, é possível inferir que 60.6% das células analisadas são positivas para as proteínas de superfície CD38 e HLA-DR. A obtenção destes dados é chamada de gating. Fonte: PATTERSON et al, 2013.

Quando utilizar a citometria de fluxo?

Dada sua versatilidade, a citometria de fluxo pode ser empregada em vários contextos. Por isso, não é possível prever uma “utilidade” principal para a técnica, ainda que ela seja o padrão escolhido para a realização de análises de imunofenotipagem e para a separação física de células (cell sorting).

Imunofenotipagem

A imunofenotipagem é uma técnica utilizada para detectar a ocorrência de determinadas reações do tipo antígeno-anticorpo. Algumas das células leucocitárias são altamente polimórficas, tornando este conjunto celular heterogêneo.

Uma das vantagens da citometria de fluxo é justamente sua capacidade multiparamétrica, tornando-a uma técnica especialmente atraente para a imunofenotipagem. 

A partir Através de reações de imunofluorescência e do uso de múltiplos canais para a detecção de sinais fluorescentes, equipamentos modernos são capazes de medir até 30 parâmetros diferentes. 

A imagem abaixo, obtida por Jimenez-Carretero, representa o resultado do experimento realizado com os padrões analíticos de um citômetro de fluxo equipado com 4 lasers e 18 detectores diferentes.

ilustração gráfica de resultados experimentais da citometria

Avaliação do Conteúdo de DNA/ciclo celular

A avaliação do conteúdo de DNA é utilizada, por exemplo, na oncologia. Com esta metodologia, é possível observar populações celulares específicas ao longo do ciclo celular, permitindo a determinação da distribuição destas populações.

Ao realizar análises multiparamétricas, cientistas também conseguem mensurar DNA e RNA simultaneamente através de marcadores moleculares específicos. A partir das informações obtidas, é possível inferir onde, no ciclo celular, as células de uma amostra se encontram.

Além disso, é possível rearranjar o sistema de espelhos/lasers para realizar análises de proliferação celular. Neste tipo de ensaio, pesquisadores miram na análise de eventos alvo, relativos à proliferação celular, como a incorporação de análogos de timidina no DNA replicante.  

Ensaios de apoptose (morte celular)

A apoptose é um evento de interesse para pesquisadores de diversas áreas, da patologia à imunologia. Este tipo de morte celular é utilizado pelo sistema imune para manter a homeostase, destruindo células sem o intermédio de reações inflamatórias.

A determinação de apoptose é realizada de maneira semelhante à avaliação do ciclo celular. Difere-se, entretanto, no tipo de marcador utilizado: aqui são utilizados marcadores moleculares associados a eventos de degradação do DNA, como é o caso do ensaio TUNEL, que mede a digestão do DNA por endonucleases.

Adicionalmente, a atividade de caspases pode ser medida a partir de colorações específicas, como de Anexina V e com Hoescht 33342.

Conclusão

A citometria de fluxo é uma técnica amplamente utilizada na biologia e na medicina. A gama de aplicações dessa técnica é grande, o que acontece em função de sua versatilidade: diferentes canais de luz, cromóforos, detectores e sistemas eletrônicos são alguns dos sistemas personalizáveis em um citômetro de fluxo.

A citometria de fluxo é realizada com a passagem de células de maneira individual sobre um feixe de luz. A luz dispersa é captada por tubos fotomultiplicadores, que transformam o sinal em dados computacionais.

Algumas de suas aplicações a serem citadas são a imunofenotipagem, a avaliação do conteúdo celular e ensaios de apoptose.

Referências

McCoy, J.P. Immunophenotyping Methods and Protocols. Springer Protocols, 2019.

McKinnon KM. Flow Cytometry: An Overview. Curr Protoc Immunol. 2018 

Cunha, C. F. et al. Citometria de Fluxo: Imunofenotipagem e Avaliação da Produção de Citocinas. Fiocruz, 2012.

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Patterson, S. et al. Cortisol Patterns Are Associated with T Cell Activation in HIV. PLOS ONE, 2015.

Herold, N.C.; Mitra, P. Immunophenotyping. StatPearls Publishing, 2022.

Jimenez-Carretero, D. et al. Flow Cytometry Data Preparation Guidelines for Improved Automated Phenotypic Analysis. J Immunol. 2018

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