Infecções virais: como é feito o diagnóstico delas?

Alguns dos desafios mais antigos da história humana estão relacionados com o enfrentamento das infecções virais. Além disso, patógenos como bactérias, fungos, vírus, helmintos (vermes) e protozoários não somente podem ser capazes de gerar dano individual a seu hospedeiro, mas carregam consigo um risco coletivo, uma vez que são transmissíveis.

O que são doenças infecciosas?

Diversos microrganismos, especialmente bactérias, estão presentes em toda a extensão do corpo humano, como na cavidade oral, na pele e nos intestinos. Nesses casos, porém, existe uma relação ecológica na qual o ser humano não é prejudicado e, às vezes, é até beneficiado.

Os casos em que a relação ecológica envolve algum prejuízo ao hospedeiro podem constituir em doenças infecciosas. Em outras ocasiões, a presença do patógeno em si, pode configurar uma infecção com potencial de transmissibilidade, semelhante ao que ocorre com os vírus.

Um exemplo evidente de doença infecciosa no mundo contemporâneo é, sem dúvidas, a COVID-19 (doença causada pelo Coronavírus), que é causada pelo vírus identificado como SARS-CoV-2 (Coronavírus da Síndrome Respiratória Aguda Grave 2). Por ser altamente transmissível, esse vírus foi capaz de gerar uma pandemia com resultados desastrosos para a humanidade em apenas alguns meses.

Ainda, outras doenças como a AIDS, a Hepatite e o Sarampo também configuram cenários em que o custo econômico e humano é muito alto e, sendo assim, se fazem necessários métodos laboratoriais capazes de detectar, reconhecer e caracterizar os microrganismos causadores destas doenças.

Vejamos na seção a seguir como isso pode ser realizado para os casos em que o patógeno é um vírus.

Quais as técnicas de diagnóstico para infecções virais? Como são realizadas?

Separamos e detalhamos a seguir, as técnicas mais populares para o diagnóstico dessas infecções, acompanhe:

Cultura celular

A propagação de vírus em meios celulares, em meados do século XX, remonta ao início dos diagnósticos laboratoriais em virologia. 

Inicialmente, eram utilizados ovos embrionados ou mesmo animais de laboratório para que o isolamento fosse realizado posteriormente. Consequentemente, os cultivos eram analisados e a infecção viral era confirmada ou descartada.

Com o desenvolvimento de linhagens celulares próprias para cultivo, a propagação induzida de vírus foi facilitada, permitindo a manipulação do patógeno com menores custo e tempo de trabalho, além de favorecer o controle de contaminações com o uso de antibióticos e de cabines de fluxo laminar. 

Nem todos os vírus, entretanto, são capazes de replicar em todos os meios disponíveis. Portanto, foi necessário o desenvolvimento de múltiplas linhagens celulares para contemplar a grande gama de patógenos a serem diagnosticados.

O indício mais comum da presença de vírus em uma determinada amostra/cultura é dado pela alteração à estrutura celular, observada através da microscopia. Essa característica leva o nome de Efeito Citopático (CPE – Cytopathic Effect). 

Outros dois métodos para a detecção da presença de vírus são chamados de Hemaglutinação (que é também é utilizado para a semiquantificação de vírions) e Hemadsorção, que se utiliza do fato de alguns vírus possuírem hemaglutininas capazes de fazer eritrócitos (hemácias) aderirem à superfície das células em cultura.

Porém, se por um lado a propagação de vírus em meios celulares viabilizou diagnósticos de infecções virais com maiores garantias, por outro, ela sozinha não foi capaz de fornecer características confirmatórias sobre a identidade molecular do patógeno.

Sendo assim, a identificação adequada do patógeno responsável pela infecção viral depende de métodos envolvendo microscopia eletrônica, sorologia ou a detecção/sequenciamento de ácidos nucleicos do vírus.

Microscopia

Uma das técnicas possíveis para a identificação de vírus é a microscopia eletrônica (de transmissão ou de varredura), que permite sua observação direta. A diferenciação é feita a partir de suas características morfológicas, que incluem tamanho, formato e características estruturais. 

Essa técnica, entretanto, tem baixa sensibilidade (requer títulos virais elevados), é altamente custosa e pode não ser capaz de diferenciar corretamente vírus pertencentes à mesma família. Mesmo assim, é eficiente para o tratamento de algumas infecções virais.

Sorologia

Os testes sorológicos são considerados parte importante dos testes diagnósticos no laboratório clínico para doenças virais e bacterianas.

A maioria dos testes sorológicos procuram anticorpos no sangue que combatem o agente causador de doenças. Estes anticorpos são produzidos depois de você ter sido infectado ou vacinado. A proteção dada por eles dura por um tempo que varia dependendo de cada doença e de cada pessoa.

Os testes de anticorpos não são os mais indicados para diagnosticar infecção atual, pois eles normalmente aparecem depois de uma ou mais semanas após a infecção, tempo para o seu corpo produzir os anticorpos.

Os mais frequentemente identificados são das classes IgG e IgM, e habitualmente os anticorpos IgM aparecem antes dos anticorpos IgG, porém são os IgG que persistem por mais tempo.

Dependendo da finalidade, a sorologia pode ser considerada como método direto ou indireto, para identificação de antígeno ou anticorpo, respectivamente.

Os três primeiros métodos são obsoletos. As técnicas mais utilizadas são as automatizadas por quimioluminescência e as manuais por ELISA, IFI, WB e Neutralização. 

A Imunofluorescência, para o diagnóstico de infecções virais, pode identificar a presença de antígenos virais ou de anticorpos com reação direta ou indireta usando fluoróforos capazes de emitir luz fluorescente quando excitados,lidas ao microscópio de imunofluorescência. Essa técnica pode ser configurada de duas maneiras:

• IF Direta: para identificar o agente viral, ou partes dele, é colocada na lâmina a amostra do paciente, podendo conter esses antígenos. Sua identificação é realizada através de anticorpos primários ligados a fluoróforos/enzima.
• IF Indireta: para identificar o anticorpo específico na amostra do paciente. Células infectadas laboratorialmente pelo vírus investigado são cultivadas. A esse cultivo é adicionado o soro do paciente, que pode conter anticorpos específicos contra esse vírus (anticorpos primários) . Após uma lavagem, são adicionados anticorpos anti-imunoglobulinas marcados revelando a presença ou ausência de anticorpos (anticorpos secundários ligados a fluoróforos/enzima).
  

Por sua vez, algumas das configurações da técnica de ELISA são semelhantes à imunofluorescência. O ensaio de Imunoabsorção Enzimática (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) é composto pela utilização de uma placa com micropoços nos quais são fixados antígenos virais ou anticorpos, a depender da configuração do ensaio. 

A essa placa fixada são adicionados, em seguida, antígenos virais ou anticorpos presentes nas amostras coletadas dos pacientes. Na sequência, é realizada uma lavagem e são incorporados anticorpos conjugados com enzimas que irão gerar luz quando o substrato adequado for adicionado, ao final do procedimento.

O ELISA é uma técnica que adicionou a possibilidade dos resultados serem quantificados com a utilização de um espectrofotômetro – uma de suas principais vantagens. 

Outro método que trouxe ainda mais melhorias à técnica de imunoensaio foi a quimioluminescência, pois permitiu aumentar sensibilidade e especificidade analítica e diagnóstica e resultados quantitativos por métodos automatizados, além de diversificar as plataformas de análise.

Diagnóstico molecular 

As técnicas de biologia molecular utilizadas no contexto das infecções virais não dependem de ligações entre antígenos e anticorpos, mas de sequências únicas presentes no material genético do patógeno.

Embora essenciais para várias análises (como a de monitoramento de terapia antiviral), seu uso para fins de diagnóstico deve ser feito de maneira cautelosa, uma vez que as sequências obtidas podem ser referentes a um vírus que esteja causando uma infecção assintomática e não seja responsável pelo quadro principal.

Ainda assim, os métodos moleculares são imprescindíveis para o diagnóstico de infecções por vírus difíceis de serem cultivados ou por aqueles que demoram a serem soroconvertidos pelo sistema imunológico. 

Um exemplo disso é o HCV (Vírus da Hepatite C) que, pelos métodos sorológicos, pode passar até 45 dias indetectado, enquanto que com métodos moleculares esse tempo cai para 15 dias.

PCR

Entre os métodos diagnósticos disponíveis, o da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é o mais comum para diagnosticar infecções virais. Sua versão clássica pode ser operacionalizada em três etapas:

• Isolamento do ácido nucléico viral a partir de uma amostra;
• Seleção da região a ser amplificada (construção do primer);
• Eletroforese do amplicon (ou detecção por hibridização).

Diversas técnicas envolvendo a PCR foram criadas e, posteriormente, incorporadas à prática clínica. No âmbito da virologia clínica, a PCR-Multiplex é uma técnica de grande destaque permitindo a incorporação de diversos primers à reação. 

Dessa maneira, uma mesma amostra pode ser testada para diversos alvos, o que facilita a detecção precisa de um patógeno quando as suspeitas não são direcionadas a um único vírus.

qPCR

Uma segunda metodologia baseada na PCR, que também tem grande valor para a virologia clínica, é a PCR em Tempo Real, também chamada de PCR Quantitativa (qPCR), que permite o monitoramento, como traz no nome, em tempo real.

A qPCR trouxe melhorias para o diagnóstico laboratorial de infecções virais que incluem:

• Eliminação da necessidade de eletroforese;
• Resultados em menos de uma hora;
• Diminuição do risco de contaminação, visto que os amplicons não precisam ser manipulados;
• Detecção de mais de um produto por reação.

Ainda que diversas outras metodologias envolvendo a PCR tenham sido incorporadas ao laboratório clínico, todas elas dependem de um fator em comum: a necessidade de primers que sirvam como referencial para a amplificação.

Em outras palavras, todas as diferentes técnicas de PCR são restritas pelos genes-alvo da hipótese formada em torno do caso clínico. Sendo assim, há limitações quanto ao diagnóstico de doenças em que o vírus ainda não é bem conhecido. Um exemplo desta situação pôde ser observado no início da pandemia de COVID-19, quando o genoma do SARS-CoV-2 ainda não havia sido sequenciado.

Sequenciamentos de Nova Geração Metagenômicos (mNGS)

As tecnologias atuais, entretanto, estão abrindo caminhos para a detecção de patógenos livre de hipóteses, ou seja, sem genes-alvo pré-estabelecidos. Os Sequenciamentos de Nova Geração Metagenômicos (mNGS) viabilizam tal realização.

Ao utilizar uma abordagem Shotgun, é possível realizar amostragens não direcionadas, proporcionando a identificação robusta, não apenas de  patógenos já sequenciados, como também de patógenos inesperados ou ainda não conhecidos.

Outra vantagem envolvida na utilização do mNGS na prática clínica está relacionada à possibilidade de obtenção de dados quantitativos acerca da concentração de organismos presentes na amostra. Isso pode ser desenvolvido a partir da contagem da leitura de sequências únicas, sendo útil nos casos em que mais de um patógeno está implicado no quadro clínico. 

Além disso, ao se realizar o sequenciamento completo do genoma de um vírus, é possível detectar variantes de um mesmo vírus com maior facilidade em relação à PCR. Isso é especialmente útil quando falamos de vírus com altas taxas de mutação como Rhinovirus e Influenzavirus, por exemplo.

Sendo assim, ao realizar um diagnóstico a partir de um genoma completo, se faz desnecessária a construção de primers (que pode ser complexa) e também a manutenção de um banco de primers a serem utilizados. Isso poderá ser substituído, no futuro, por bancos de dados e buscas através de alinhamentos no BLAST.

Por fim, uma vez que os vírus não possuem um marcador molecular universal (como o rRNA 16S presente em bactérias), é importante perceber que o tratamento da amostra é uma parte primordial de uma análise metagenômica com finalidade diagnóstica. Esse tratamento pode consistir em métodos de depleção do material genético humano (como a utilização de DNAses) ou direcionando o sequenciamento.

Entenda mais sobre o assunto em: Viroma: medicina de precisão para doenças infecciosas virais

Afinal, qual é o melhor método de diagnóstico laboratorial de infecções virais?

Para respondermos essa pergunta são necessárias informações sobre, por exemplo, os objetivos do laboratório e do exame e, também, sobre questões orçamentárias. Todos os métodos possuem vantagens e desvantagens para determinadas aplicações.

Evidencia-se de suma importância  definir com clareza  aquilo que se procura investigar, como a fase da doença em que o paciente se encontra ou qual a  quantidade de patógeno presente na amostra. 

A tabela a seguir traz algumas delas para os diferentes métodos apresentados anteriormente.

Referências

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