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Exoma como ferramenta de diagnóstico clínico

O sequenciamento de exoma completo é uma ferramenta de diagnóstico clínico capaz de revelar variantes e direcionar o tratamento de pacientes.

O sequenciamento de exoma completo consiste na identificação de todos os genes do genoma que codificam para proteínas (éxons). Atualmente, ele é utilizado como uma ferramenta de diagnóstico clínico pelo mundo todo.

O exoma foi rapidamente aceito pela comunidade médica pois apresenta resultados precisos e auxilia na solução de casos que não apresentam diagnóstico definido. Ele permite que você avalie não só os genes relacionados com a doença suspeita mas também outras variantes, eventualmente encontrando resultados inesperados como mais de um distúrbio no mesmo paciente.

Porque criar o exame de sequenciamento de exoma completo?

É importante pensar na utilidade clínica na hora de criar um novo exame, por exemplo, nos efeitos do diagnóstico, implicações no prognóstico, benefícios na saúde e psicológicos, assim como seu impacto econômico em sistemas de saúde.

Apesar do exoma ser uma parte pequena do genoma humano, estima-se que 85% das mutações que ocorrem em suas sequências levam ao desenvolvimento de uma doença.

Dessa forma, em 2009, saiu o primeiro artigo que utilizou o sequenciamento de exoma completo como diagnóstico clínico.

Um paciente com suspeita de síndrome de Bartter, uma doença rara de perda renal de potássio, teve seu exoma sequenciado e apresentou uma mutação homozigótica missense no locus de diarréia congênita por cloreto (SLC26A3). O paciente foi observado e o diagnóstico foi confirmado. Em adição, estudaram outros cinco pacientes que tinham suspeita de possuir a síndrome e viram que eles apresentavam mutações deletérias homozigóticas no mesmo locus.

Muitas vezes os médicos são capazes de identificar a origem dos sintomas que acometem os pacientes, mas não qual é de fato a  sua causa. Por exemplo, é possível identificar que uma criança possui problemas  de desenvolvimento mas não o porquê, se existe algum tratamento ou como pode ocorrer o desenvolvimento dessa doença. 

O paciente também tem interesse em saber se a doença é hereditária, se há um risco de recorrência. Dessa forma,muitas vezes o exoma é feito no trio, ou seja, não só no paciente de estudo (probando) mas também em seu pai e mãe. 

Quando o assunto são doenças genéticas, muitas vezes acredita-se que um diagnóstico sem tratamento viável não tem utilidade, no entanto, ela pode ser extremamente importante na qualidade de vida do paciente e no preparo psicológico dele e de sua família.

O sequenciamento do exoma completo pode ser responsável por identificar a necessidade de alterar ou remover algum medicamento, assim como sinalizar que algum sintoma pode se desenvolver, de modo que no momento que apareça não seja negligenciado.

Um estudo de 2014 observou que de 41% de crianças diagnosticadas como positivas para doenças genéticas por exoma, para 44% delas não havia nenhum teste disponível para identificar os genes que apresentaram mutações. Atualmente, após revisão dos dados, alguns casos reportados como negativos por esse estudo já se tornaram positivos com variações em novos genes identificados.

Atualmente o custo de um sequenciamento de nova geração é viável e, objetivamente, quando analisamos os benefícios de realizar um sequenciamento de exoma completo, fica evidente o porquê desse começar a ser utilizado em rotinas de diagnósticos clínicos.

Além de abranger uma quantidade maior de genes, ele é capaz de apresentar resultados mais completos, muitas vezes solucionando casos após muitos outros exames terem sido realizados.

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Quando fazer o sequenciamento do exoma completo?

Primeiramente, é importante que o médico realize uma avaliação clínica constatando o histórico médico e familiar, assim como uma análise de fenótipos completa. A ACMG (American College of Medical Genetics) determinou em seu guia de práticas para sequenciamentos de nova geração que é essencial que esses dados fenotípicos sejam fornecidos para os laboratórios de modo a auxiliar na análise dos resultados.

Entenda sobre as diretrizes da ACMG no texto: ACMG: Diretrizes para exames genéticos

A ACMG é responsável por determinar as normas e diretrizes na realização do sequenciamento de exoma completo assim como na interpretação e análise de variantes detectadas.

Ela recomenda usar o sequenciamento de exoma completo quando:

  • Não há exame de painel ou gene-específico para o que se busca: Quando os dados do paciente indicam que a origem da doença é genética, no entanto, não há um teste genético que analise um gene especifico de interesse.
  • Há muitos genes para testar e não é interessante testá-los separadamente
  • Já foram realizados outros testes genéticos sem resultados efetivos

Em quais casos clínicos é recomendado o sequenciamento de exoma completo:

  • Suspeita de causa genética sem diagnóstico clinico definido.
  • O fenótipo possui muitos genes associados a ele.
  • Diagnóstico clínico sem um teste direcionado.
  • Alta complexidade ou doenças raras.
  • Resultado do diagnóstico deu negativo, no entanto, não houve resposta sobre o fenótipo.
  • Resultado positivo, no entanto, apenas respondeu parte do fenótipo.

O que não é confiável detectar por sequenciamento de exoma completo:

  • Pseudogenes
  • Regiões repetitivas ou altamente homologas
  • Áreas ricas em GC
  • Rearranjos estruturais (inversões e translocações)
  • Repetição de trinucleotídeo
  • Mosaicismo de baixo grau
  • Defeitos em regiões não codificantes

Como reportar as análises e resultados

Uma vez que o processamento da amostra é feito e ela é sequenciada, seus dados brutos são utilizados nas análises de bioinformática e, posteriormente, na interpretação das variantes chamadas, ou seja, no que será reportado de volta para o paciente.

Inicialmente um arquivo FastQ, que contém as sequências de nucleotídeo, se unem no arquivo BAM (Binary Alignment Map). Esse arquivo representa o alinhamento dos dados do sequenciamento com um genoma de referência e é ele que será utilizado para a chamada de variantes. A partir do BAM conseguimos chegar ao VCF, um arquivo de texto que armazena as variantes chamadas.

Considerando que o exoma completo compreende uma gama enorme de dados, é muito importante, na hora de realizar as análises dessas variantes chamadas, que o fenótipo esteja bem reportado, uma vez que ele será um dos filtros que direcionam para os genes relacionados às doenças suspeitas. 

Da mesma forma, quando possível, é interessante que o sequenciamento seja feito em trio. Avaliando pai e mãe é possível saber quais variantes priorizar e identificar caso ocorra uma mutação, se ela foi hereditária ou “de novo”.

Os resultados do sequenciamento de exoma completo podem identificar as variantes patogênicas ou benignas relacionadas ao fenótipo estudado, mas também podem apontar alterações inesperadas que justifiquem esse ou outros fenótipos que o paciente possa apresentar. 

Uma dificuldade comum na hora de decidir o que reportar na formação de um laudo de exoma completo, são as variantes de significado incerto.

Dessa forma, a ACMG criou um documento indicando que os genes que forem encontrados de forma secundária na análise dos sequenciamentos de exoma completo devem ser descritos quando são bem reconhecidos, apresentam um link considerável com a causa da doença ou quando podem ter a capacidade de ajudar na prevenção ou tratamento do paciente.

Por fim, análises que são realizadas com base em sequenciamento estão em constante mudança. Além das normas serem reavaliadas com certa periodicidade, os bancos de dados que compreendem novos genes e doenças genéticas aumentam e são atualizados cada vez mais rápido com o passar dos anos. Dessa forma, é importante que os laboratórios definam protocolos bem estabelecidos para reanálise das variantes para que os resultados estejam sempre consistentes com a literatura. 

Para auxiliar nesses complexos processos, não hesite em acessar a Varstation e ver os benefícios de utilizar uma plataforma totalmente otimizada para melhoria do processo de análise de variantes genômicas.

Como o exoma mudou a perspectiva do diagnóstico clínico

O uso do sequenciamento do exoma completo aumentou exponencialmente a precisão dos diagnósticos, não apenas revelando novas doenças e auxiliando na identificação das já existentes, mas também apontando quando o direcionamento inicial não estava correto. Em muitos casos ele foi o diferencial na descoberta da origem do fenótipo após diversos exames genéticos já terem sido realizados.

Assim como a maior parte dos conhecimentos referentes ao genoma humano, ainda há muito a ser elucidado no que diz respeito à capacidade do sequenciamento de exoma completo, no entanto,  sua enorme contribuição no diagnóstico clínico já está bem estabelecida.

Referências

  • Dixon-Salazar TJ, et al. Exome Sequencing Can Improve Diagnosis and Alter Patient Management. (2012) Sci Transl Med 4(138):138-78. Doi: 10.1126/scitranslmed.3003544
  • LaDuca H et al. Exome sequencing covers >98% of mutations identified on targeted next generation sequencing panels. (2017) PLOS ONE. Doi: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0170843
  • Choi M, et al. Genetic diagnosis by whole exome capture and massively parallel DNA sequencing. (2009). Proc Natl Acad Sci 106(45):19096-101. Doi: 10.1073/pnas.0910672106.
  • Siddharth MDS, et al. Meta-analysis and multidisciplinary consensus statement: exome sequencing is a first-tier clinical diagnostic test for individuals with neurodevelopmental disorders. (2019) Gen Med 21:2413-2421. Doi: https://doi.org/10.1038/s41436-019-0554-6
  • Pemberton L, et al. Case report: targeted whole exome sequencing enables the first prenatal diagnosis of the lethal skeletal dysplasia Osteocraniostenosis. (2020). BMC Med Gen 21:7. Doi: 10.1186/s12881-019-0939-z
  • Normas padrão e guias da ACMG

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