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Com a chegada de novas linhagens do SARS-CoV-2, pesquisadores e autoridades de saúde têm manifestado preocupação com possíveis falhas do padrão-ouro de diagnóstico molecular por RT-PCR. Isso acontece principalmente porque a cepa B.1.1.7 originada no Reino Unido apresenta duas mutações de deleção características na proteína Spike, que é justamente uma das regiões utilizadas por kits comerciais de diagnóstico.
É preocupante, mas as técnicas empregadas pelos principais laboratórios do Brasil utilizam simultaneamente mais de uma região do genoma do vírus com o objetivo de proporcionar um diagnóstico mais preciso e com menos falso-negativos. Logo, se a amplificação de uma das regiões falhar devido a uma mutação como a da linhagem B.1.1.7, outra região irá gerar a amplificação e consequentemente o resultado positivo esperado.
Método de detecção de novas linhagens do SARS-CoV-2 por RT-PCR
O método de detecção de patógenos por RT-PCR (da sigla em inglês: Reverse Transcription Polimerase Chain Reaction) é considerado o padrão-ouro no diagnóstico molecular. Isso porque a técnica é capaz de identificar fragmentos do genoma de um organismo em quantidades muito baixas, geralmente na casa das 100 a 1000 moléculas por mL de amostra.
Exames de RT-PCR exigem o planejamento e padronização do ensaio experimental, sendo constituído principalmente dessas quatro etapas:
- Extração do material genético da amostra, o que no caso do novo coronavírus seria a extração do RNA total presentes em amostras de swab respiratório;
- Realização da transcrição reversa do RNA -> DNA;
- Amplificação de regiões específicas do DNA utilizando primers específicos desenhados especialmente para esta finalidade;
- A presença do material genético do patógeno permite a amplificação dos fragmentos, que geram um sinal luminoso lido por um equipamento e interpretado como positivo para a presença do patógeno.
O que torna o RT-PCR específico para um patógeno?
Dentre as quatro etapas citadas acima, a terceira é customizável e altamente dependente dos primers utilizados. Estes primers são sequências específicas de nucleotídeos (ACTG…) sintetizadas artificialmente que procuram pelo alvo no genoma para gerar sua amplificação. Primers podem ser desenvolvidos para qualquer região de um genoma, bastando para isso conhecer a sequência completa do patógeno de interesse. No caso do SARS-CoV-2, o genoma de referência dos primeiros casos em Wuhan é conhecido e publicamente disponível no banco de dados do NCBI.
A maioria dos primers utilizados em kits comerciais disponíveis atualmente foram desenvolvidos baseados na sequência referência do vírus de Wuhan, e esse pode ser o grande motivo para preocupação. Se a linhagem circulante no Brasil por exemplo possuir mutações nas regiões alvos dos primers, eles simplesmente perdem eficiência e em casos extremos, podem parar de funcionar.
A maioria dos primers utilizados em kits comerciais disponível atualmente foram desenvolvidos baseados na sequência referência do vírus de Wuhan, e esse pode ser o grande motivo para preocupação. Se a linhagem circulante no Brasil, por exemplo, possuir mutações nas regiões alvos dos primers, eles simplesmente perdem eficiência e em casos extremos, podem parar de funcionar.
Como evitar falhas no exame de RT-PCR?
Levando estas informações em consideração, os pesquisadores e fabricantes quase sempre utilizam mais de uma região do genoma do patógeno no ensaio de RT-PCR. Por exemplo, um fragmento na região da proteína Spike e outro na região da proteína Nucleocapsid (N). Assim, as chances de uma falha completa do ensaio diminui muito. Para reforçar boas práticas, a ANVISA emitiu uma nota técnica no dia 1 de Janeiro recomendando que os laboratórios utilizem kits de RT-PCR com mais de um alvo viral. Veja abaixo quais são as regiões utilizadas pelos principais kits comerciais disponíveis atualmente.
Além disso, alguns fabricantes desenvolvem primers que chamamos de degenerados. Essa classe especial de primers leva em consideração algumas variações que podem ocorrer no genoma do patógeno, possuindo várias versões possíveis da sequência. Assim, caso um dos primers perca a eficiência de amplificação, uma versão alternativa dele resolverá o problema.
Monitoramento genômico das mutações em SARS-CoV-2
Apesar do RT-PCR ser o padrão-ouro no diagnóstico e detecção de novas linhagens do SARS-CoV-2, há de se reconhecer suas limitações como em qualquer outro exame. O RT-PCR é capaz de gerar um resultado qualitativo da presença do vírus, ou um resultado quantitativo da carga viral. Porém, ele não é capaz de gerar resultados detalhados sobre a sequência e mutações do vírus. Para isso, apenas o sequenciamento e genotipagem pode ser empregado.
São poucos os laboratórios que oferecem este exame, sendo o Hospital Albert Einstein um exemplo. Adicionalmente, é importante que os laboratórios e pesquisadores sigam sequenciando o genoma do vírus em rotina para identificar mutações e, consequentemente, identificar falhas de diagnóstico por RT-PCR o quanto antes.
Autores
Deyvid Amgarten, Doutorando em Bioinformática e Genômica Viral pela Universidade de São Paulo. Bioinformata no Hospital Israelita Albert Einstein e no projeto SARS-Omics
João Renato Rebello Pinho, Médico Patologista Clínico do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da USP e do Departamento de Medicina Laboratorial do Hospital Israelita Albert Einstein. Pesquisador responsável do projeto SARS-Omics
Referências
Kubina, Robert, and Arkadiusz Dziedzic. “Molecular and serological tests for COVID-19 a comparative review of SARS-CoV-2 coronavirus laboratory and point-of-care diagnostics.” Diagnostics 10.6 (2020): 434.
Preliminary genomic characterisation of an emergent SARS-CoV-2 lineage in the UK defined by a novel set of spike mutations
