O que é PCR em tempo real (qPCR)?

Desenvolvido no final dos anos 80 por Kary Mullis, que ganhou o Nobel Chemistry Award por sua descoberta, a PCR em tempo real revolucionou as técnicas de genética molecular.

Usada na rotina de laboratórios para fazer milhões ou bilhões de cópias de DNA que são de interesse do pesquisador, essa técnica pode ser aplicada para:

• identificação genética;
• medicina forense;
• análises clínicas;
• diagnóstico de doenças;
• controle de qualidade industrial;
• entre outros campos.

Neste artigo, separamos algumas informações sobre a tecnologia e suas funcionalidades, para facilitar a compreensão. Vamos lá?

O que é PCR?

A tecnologia de PCR em tempo real baseia-se na duplicação do DNA in vitro que pode ser repetida várias vezes, resultando em milhões de cópias com apenas um fragmento de DNA. Com essa quantidade de DNA, é possível realizar várias análises.

A PCR é um método muito sensível, específico e rápido, comparado a outros testes, levando de 2 a 3 horas para apresentar o resultado. Por esse motivo, eles são amplamente utilizados em infectologia clínica para a detecção de patógenos e identificação bacteriana e viral, como o COVID-19.

Além disso, é utilizado no diagnóstico de oncologias e doenças genéticas, identificando mutações e predisposição genética para certas doenças.

Saiba mais sobre o DNA em: Genética: o que é o DNA, o genoma e o que são genes?

Componentes para a PCR

• Amostra de DNA de interesse: fita de DNA modelo;
• Primers: uma curta sequência de nucleotídeos que fornece um ponto de partida para a síntese de DNA pela polimerase Taq;
• Taq polimerase: proteína capaz de produzir novas fitas de DNA usando uma fita existente como modelo;
• Nucleotídeos: utilizados pela Taq polimerase para a construção das novas fitas;
• Buffer: Tampão que mantém os componentes da reação em um estado ideal e pH ideais: Tris-HCl, cloreto de potássio (KCl) e cloreto de magnésio (MgCl2).

Processo

A reação é realizada no termociclador, um dispositivo que permite programar a temperatura e o tempo.

• Desnaturação (95ºC): aquece a reação para que o DNA desnature, ou seja, a cadeia dupla de DNA se separa, fornecendo um modelo de cadeia única;
• Anelamento ( [Em torno de] 55ºC): a temperatura mais baixa faz com que os primers se liguem à fita de DNA;
• Extensão (72ºC): com o ponto de partida já identificado, a Taq polimerase liga a fita sinalizada pelo primer. Em seguida, começa a extensão do novo fragmento de DNA, formando novamente uma dupla fita de DNA.

Esse processo é repetido 25 a 35 vezes e geralmente ocorre em 2 a 4 horas, dependendo da extensão da região do DNA a ser copiada. Os resultados da PCR convencional são visualizados no final do processo.

Esse processo é rápido, porque não apenas o DNA original é usado como modelo, mas também os novos DNAs, que servem como modelos para a síntese de mais cópias. Portanto, esse padrão de crescimento é exponencial.

qPCR: PCR em Tempo Real

Uma reação em cadeia da polimerase em tempo real (PCR em tempo real), também conhecida como reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) é uma evolução do método de PCR convencional. É baseado na PCR convencional, mas o resultado é visualizado imediatamente. Existem dois métodos comuns para a detecção de DNA amplificado:

• Corantes fluorescentes: liga-se a qualquer DNA de fita dupla.
• Sondas de DNA: DNA específico da sequência que é marcado com um repórter fluorescente, que permite a detecção somente após a hibridação da sonda em sua sequência complementar.

Portanto, em qPCR, a amplificação de DNA é monitorada em cada ciclo de PCR. Existem inúmeras aplicações para a cadeia quantitativa da polimerase, e é comumente usado para pesquisas básicas e de diagnóstico.

Referências:

[1] DEEPAK, S. A. et al. Real-time PCR: revolutionizing detection and expression analysis of genes. Current genomics, v. 8, n. 4, p. 234-251, 2007.

[2] KUBISTA, Mikael et al. The real-time polymerase chain reaction. Molecular aspects of medicine, v. 27, n. 2-3, p. 95-125, 2006.

[3] RAMAKERS, Christian et al. Assumption-free analysis of quantitative real-time polymerase chain reaction (PCR) data. Neuroscience letters, v. 339, n. 1, p. 62-66, 2003.

[4] WILHELM, Jochen; PINGOUD, Alfred. Real‐time polymerase chain reaction. Chembiochem, v. 4, n. 11, p. 1120-1128, 2003.