Dispositivo para sequenciamento de terceira geração

Sequenciamento de Terceira Geração: reads ultralongos

Você já conhece a tecnologia de ponta quando o assunto é sequenciamento genético? Entenda sobre o Sequenciamento de Terceira Geração.

A invenção de tecnologias de sequenciamento genético permitiu que cientistas pudessem vislumbrar a sucessão de bases nitrogenadas presentes nos seres vivos, tirar conclusões a partir disso e dar passos adiante no entendimento da vida. O Sequenciamento de Nova Geração permitiu que os avanços e descobertas na área de genômica evoluíssem ainda mais rapidamente.  Neste artigo discutiremos sobre como os métodos de sequenciamento evoluíram até o atual Sequenciamento de Terceira geração (sequenciamento de molécula única) e quais são as perspectivas para o futuro do sequenciamento genético.

A evolução do sequenciamento

O pontapé inicial no sequenciamento genético foi dado por Maxam e Gilbert na década de 70. Apesar disso, Frederick Sanger foi quem teve a brilhante ideia de fragmentar um DNA de interesse em todos os comprimentos possíveis e analisá-lo com o auxílio da eletroforese. Esse método ficou conhecido como Sequenciamento Sanger e ele constitui a maior parte do chamado Sequenciamento de Primeira Geração. 

Em seguida, com o advento da PCR e do emprego de lasers na pesquisa, bem como de computadores com maior capacidade de processamento, surgiram as técnicas de Sequenciamento de Segunda Geração (ou SGS – Second Generation Sequencing). 

Essas novas técnicas, embora possuam métodos variados, são caracterizadas pelo sequenciamento paralelo em massa automatizado, capaz de processar milhões ou até bilhões de fragmentos curtos de DNA por uma fração do tempo e dos custos dos métodos anteriores. 

Nos tempos atuais, a tecnologia na área da genômica está dando mais um grande passo ao dar origem ao Sequenciamento de Terceira Geração (TGS – Third Generation Sequencing), sendo vista por alguns pesquisadores como um verdadeiro renascimento dos métodos de sequenciamento genético de alta qualidade. Vejamos a seguir suas principais características.

O Sequenciamento de Terceira Geração ou Sequenciamento de Leituras Longas

A principal característica dessa classe de sequenciamento é sua capacidade de utilizar fragmentos longos de DNA, num processo chamado de sequenciamento de molécula única (Single Molecule Sequencing – SMS).

Enquanto o Sequenciamento de Segunda Geração utiliza fragmentos de DNA com tamanhos equivalentes a algumas centenas de pares de bases, no SMS é possível fazer a leitura e análise de fragmentos de dezenas de milhares destas. 

Além disso, uma segunda particularidade do Sequenciamento de Terceira Geração é a eliminação da etapa de amplificação do material de interesse através da PCR, diminuindo custos e também o tempo de preparação da amostra. 

Seja pela utilização de nucleotídeos marcados e sua análise em tempo real ou pelo emprego de nanoporos, não são mais necessárias grandes quantidades de amostra, viabilizando tanto a análise de materiais de difícil obtenção como também a diminuição do erro causado pelo viés de amplificação.

Principais Plataformas de Sequenciamento de Terceira Geração

Pacific Biosciences

O primeiro equipamento de Sequenciamento de Terceira Geração disponível no mercado foi o chamado ‘Sequel’, apresentado pela Pacific Biosciences ainda em 2010. 

Este sequenciador utiliza uma tecnologia intitulada “Sequenciamento de Molécula Única em Tempo Real” (SMRT), capaz de identificar os nucleotídeos investigados no exato momento em que são adicionados pela DNA-polimerase. 

O mecanismo de SMRT faz uso de dNTPs marcados com fluoróforos. Na medida em que esses dNTPs são incorporados à uma nova fita de DNA circular, um laser incide sobre os marcadores, fazendo com que um sinal fluorescente seja emitido

Esse sinal é captado em tempo real por um detector óptico que mede sua intensidade e tempo, de tal modo que seus valores sejam traduzidos em sequências específicas de bases nitrogenadas. 

Quais são as principais características do sequenciador Pacific Biosciences?

• Detectar bases modificadas, uma vez que o sinal detectado é uma função dependente do tempo de incorporação de dNTPs.

• A possibilidade de leitura de fragmentos de até 50.000 pares de bases garante a montagem e sobreposição desses fragmentos com maior precisão.

• Maior resolução de regiões repetitivas e de variantes estruturais.

Representação esquemática da excitação de fluoróforos acoplados aos dNTPs e da emissão de sinais a serem captados. Fonte: Rhoads, 2015.

MinION: Oxford Nanopore Technologies

Em 2014, um segundo sequenciador foi introduzido no mercado pela Oxford Nanopore Technologies. O sequenciador MinION, que possui o tamanho de um pendrive, faz uso de um nanoporo presente em uma membrana para realizar leituras. 

Seu mecanismo de funcionamento consiste em submergir a membrana em uma solução iônica e aplicar um potencial capaz de gerar uma corrente elétrica conhecida sobre o nanoporo. Em seguida, uma DNA-helicase ‘abre’ a fita de DNA, tornando-a apta para atravessar o poro. 

Por fim, a passagem de cada um dos quatro tipos de nucleotídeos pelo poro gera variações características da corrente, que podem ser registradas por um detector semicondutor adequado e traduzidas em termos de bases nitrogenadas. 

Representação esquemática da passagem de um ssDNA por um nanoporo capaz de detectar variações em sua corrente elétrica. Fonte: Wikimedia Commons, 2020.
Quais são os principais benefícios do sequenciador MinION?

• Sua portabilidade dispensa a necessidade de um setup laboratorial complexo, podendo ser utilizado no trabalho de campo apenas com o auxílio de um laptop.

• Velocidade: existem hoje ensaios baseados nessa plataforma que permitem a identificação de oncogenes em apenas cinco minutos.

• A leitura de fragmentos grandes permite uma excelente abordagem para o sequenciamento de genomas que não possuem outro como referência (de novo assembly).

É importante notar que novos sequenciadores estão em constante desenvolvimento, buscando aumentar suas capacidades de leitura, bem como diminuir taxas de erro e custo. Desse modo, tanto a Pacific Biosciences quanto a Oxford Nanopore Technologies já possuem novos sequenciadores de terceira geração, como o Sequel II e o PromethION, respectivamente. 

Qual a diferença entre sequenciamentos de primeira, segunda e terceira geração?

Como citado anteriormente, a principal diferença das tecnologias de sequenciamento de terceira geração é sua capacidade de leitura de milhares de pares de bases por corrida. Mas, além dessa, quais são as outras características que as distinguem de suas antecessoras?

Observemos a tabela a seguir, que considera diferentes equipamentos de diferentes épocas:

Sequenciamento de terceira geração comparação
Diferenças entre os sequenciadores de primeira, segunda e terceira geração

Quais as vantagens e desvantagens da utilização do Sequenciamento de Terceira Geração?

Uma das vantagens mais evidentes ao se utilizar um TGS é que suas leituras ultra longas permitem montagens de sequências com uma facilidade sem precedentes quando comparada com as tecnologias anteriores. 

Aliado a isso, sequenciadores de terceira geração possuem menor viés gerado pelo conteúdo GC, o que viabiliza leituras genômicas mais uniformes, inclusive de regiões onde o Sequenciamento de Segunda Geração apresenta problemas para resolver.

Estas novas tecnologias também permitiram novas análises em genomas diplóides, como a partir de haplótipos nos quais a contribuição materna e paterna para uma mesma região homóloga é diferente.

De maneira ainda mais específica, o Sequenciamento de Terceira Geração permite um entendimento mais amplo em torno de haplótipos colapsados ou que possuem uma mistura paterna/materna, impedindo resultados que apontam quimerismo genético onde não há. 

Isso abre caminhos para a detecção acurada de Variações Estruturais (SV – Structural Variations), hoje reconhecidas como tendo um papel biológico muito importante na diferenciação genética dos seres, juntamente com os SNPs. Essas detecções podem ser realizadas, atualmente, para cinco variações estruturais: inserções, deleções, duplicações, translocações e inversões. 

Sendo assim, essas técnicas têm grande relevância não somente para a pesquisa mas também para a prática clínica.

Representação esquemática das cinco variações estruturais sujeitas à detecção por TGS.

Por outro lado, o maior problema a ser superado pelas técnicas de sequenciamento de terceira geração envolve sua grande taxa de erro de identificação de bases, que está relacionado com seus próprios fundamentos técnicos. 

Ao se utilizar apenas uma molécula de DNA para o sequenciamento também se utiliza apenas uma DNA-helicase (ou apenas uma DNA-polimerase). Isso se constitui num desafio pelo fato de que enzimas possuem limitações termodinâmicas que, quando não respeitadas, tendem a resultar em desnaturação e, consequentemente, em erros de identificação.

Por fim, um segundo problema apresentado pelo Sequenciamento de Terceira Geração reside no campo da bioinformática. Uma vez que os sinais a serem captados/armazenados são emitidos em alta velocidade, um grande poder computacional se faz necessário para o processamento de dados. 

Dessa maneira, utilizar técnicas desse tipo requer hardwares potentes, bem como softwares de sequenciamento otimizados/desenvolvidos para essa finalidade.

O futuro do sequenciamento genético

As maneiras com que os cientistas descobrem e analisam as sequências de nucleotídeos presentes em genes ou genomas inteiros mudaram radicalmente ao longo do tempo, concedendo aos seres humanos uma compreensão cada vez mais adequada sobre a vida e sobre como lidar com questões de saúde que a rodeiam. 

Embora os sequenciadores de terceira geração tenham possibilitado aos cientistas que enxerguem mais longe, eles não são uma alternativa absoluta aos seus antecessores. Se é verdade que eles possuem grandes vantagens para algumas aplicações, também é verdade que possuem desvantagens para outras, em que o Sequenciamento Sanger e o SGS se saem melhor.

Por isso, é digno de nota que o sequenciamento de terceira geração ainda está sob desenvolvimento e ainda tem bastante espaço para melhora e, por isso, possivelmente não deixará tão cedo de ser a tecnologia de ponta em sequenciamento genético.

Apesar disso, já existem candidatos para integrar a classe de sequenciadores de quarta geração, como, por exemplo, o sequenciamento genômico in-situ desenvolvido pelo MIT. Essa técnica de sequenciamento tem como objetivo realizar sequenciamentos em amostras biológicas intactas, dando grande espaço para a pesquisa em genética com foco no desenvolvimento embrionário.

Não sabemos, ainda, quais serão os próximos passos das tecnologias de sequenciamento, porém sabemos suas implicações: ainda mais conhecimento sobre os vários campos da genética humana e também da oncologia. 

O mapeamento mais adequado de doenças genéticas, diagnósticos para essas doenças, mais programas de medicina personalizada e avanços no entendimento e tratamento do câncer são apenas alguns exemplos entre os tantos possíveis com a evolução das técnicas de sequenciamento genético.

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