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Exames com microarray surgiram no contexto da pesquisa, entretanto, hoje são utilizados em exames clínicos. Com maior resolução que exames de cariotipagem tradicionais, eles podem ser utilizados para detectar alterações pontuais no DNA, o que pode servir de subsídio para diagnósticos de condições genéticas e para tratamentos personalizados via estudos farmacogenéticos.
Quer saber mais sobre microarray? Acompanhe o texto para entender o que é, como é realizada e quais metodologias empregam esta tecnologia!
O que é microarray?
O microarray, ou microarrays (microarranjos) são ferramentas utilizadas por pesquisadores e profissionais da saúde para a realização de análises genéticas.
Eles consistem em substratos sólidos, sobre os quais são fixados fragmentos específicos de DNA (sondas) capazes de reconhecer regiões específicas do material genético de uma amostra.
Com isso, é possível detectar a presença ou ausência de milhares de sequências genéticas em uma amostra a partir de um único ensaio, muitas vezes com precisão maior que 99%. Como veremos na sequência, essa metodologia é especialmente útil para as áreas de:
- Farmacogenômica;
- Toxicogenômica;
- Oncologia;
- Neurogenética.
O exame Microarray: processo
A execução de um ensaio de microarray consiste no princípio de complementaridade de ácidos nucleicos. Essa propriedade é o que permite a hibridização entre as sondas de DNA fixadas no suporte sólido e a sequência alvo a ser analisada.
Inicialmente, as sequências de interesse (sondas) são sintetizadas e fixadas mecanicamente sobre uma placa de vidro, plástico ou, ainda, sobre um chips de silício, este processo é chamado de ‘spotting’.
Tais sondas podem ser oligonucleotídeos sintéticos ou cópias de mRNA (cDNA) amplificadas por PCR. Além disso, um mesmo chip de microarray pode conter centenas de milhares de diferentes sondas.
Em paralelo, os materiais genéticos a serem analisados (alvos) devem ser extraídos e isolados. Quando o ensaio visa quantificar a expressão de determinados genes, os mRNAs são convertidos em cDNAs por transcrição reversa, que são amplificados e posteriormente marcados fluorescentemente.
Na sequência, o material em análise é depositado sobre os poços (pontos) nos quais as sondas estão fixadas. Dessa forma, os cDNA em análise que encontrarem correspondentes na placa irão hibridizar.
Após o período de incubação, a placa é lavada para que os cDNA sem correspondência sejam retirados. Por fim, a placa é inserida em um scanner próprio para análises de microarray, que excita os marcadores fluorescentes para que emitam luz (sinal), que é captado e processado pelo equipamento.
Em um exemplo prático, é possível comparar a expressão de determinados genes entre células saudáveis e células tumorais.
Ao marcar os materiais genéticos destas duas células com cores diferentes, é possível hibridiza-los com as sondas de sequência conhecida e, posteriormente, avaliar quais genes estão sendo expressos por estas duas células (e se uma expressa mais determinado gene do que outra).
Principais utilizações do Microarray
Os ensaios com microarray foram inicialmente elaborados para estudos de expressão gênica, entretanto, os cientistas rapidamente perceberam a versatilidade desta técnica. Hoje, microarrays são utilizados no contexto clínico e da pesquisa para avaliar também a presença de variantes genéticas, inclusive variantes de nucleotídeo único.
Adicionalmente, microarrays podem ser pareados com outras técnicas, permitindo a análise de:
- miRNA;
- lncRNA;
- Peptídeos;
- Expressão gênica em tecidos específicos;
- Transcritos de fusão;
- Mosaicismo;
- Perda de heterozigose;
- Variação no número de cópias.
Condições detectadas pelo exame
Segundo o Colégio Americano de Medicina Genética, estudos com microarrays são um método de escolha na investigação de adultos com suspeitas de síndromes genéticas, atraso do desenvolvimento neuropsicomotor e autismo.
Estes exames possuem uma resolução maior do que a cariotipagem tradicional, realizada por microscopia. Isso beneficia alguns diagnósticos, como:
- Deficiência intelectual;
- Autismo;
- Atraso de desenvolvimento neuropsicomotor;
- Convulsões;
- Atraso do crescimento;
- Atraso da linguagem;
- Malformações congênitas.
Metodologias
Como colocado anteriormente, ensaios envolvendo microarrays podem ser executados com diferentes metodologias. Além de seu emprego no perfilamento da expressão gênica, no qual milhares de genes podem ser observados, também é possível utilizar ensaios com microarray na genotipagem e no lugar da cariotipagem tradicional.
Isso acontece porque a resolução dos exames de cariotipagem realizados por microscopia não é suficiente para detectar alterações com tamanho menor que 10Mnt, enquanto microarrays são capazes de detectar até mesmo variantes de um único nucleotídeo (SNP/SNV).
Confira na sequência duas das metodologias de microarray executadas no Hospital Israelita Albert Einstein.
SNP-array
Polimorfismos de Nucleotídeo Único (SNP) são o tipo mais comum de variação genética e são caracterizados pela troca de um único nucleotídeo (A, C, G, T) por outro. Este tipo de mutação contrasta com as chamadas variantes estruturais, nas quais ocorrem alterações envolvendo dezenas de milhares de nucleotídeos.
Os SNP podem ser detectados por sequenciamento genético ou, em alguns casos, por SNP array. A execução desta última técnica é bastante semelhante ao microarranjo de DNA utilizado no perfilamento de expressão gênica.
Uma diferença, entretanto, é o fato de que no SNP-Array as sondas utilizadas são menores do que aquelas utilizadas no microarray para expressão gênica.
Além disso, SNP-Arrays avaliam somente dois alelos um único nucleotídeo por sequência, embora milhares de sequências possam ser testadas simultaneamente.
CGH+SNP array
A Hibridização Genômica Comparativa atualmente também é uma técnica baseada em ensaios com microarray. Nela, porções cromossômicas (cujo tamanho é determinado pelo analista) são utilizadas como sondas fixadas à placa/chip.
Ao marcar a sequência de DNA a ser testada com um fluoróforo e uma sequência de DNA de referência (controle) com outro fluoróforo, é possível obter resultados que expressam compatibilidade entre amostra e controle ou a presença de Variações no Número de Cópias (CNV).
Em outras palavras, o CGH array é capaz de detectar rearranjos cromossômicos não balanceados (como deleções e duplicações). Sendo assim, o pareamento entre esta técnica com o SNP array é considerado um método de escolha pela Academia Americana de Genética no estudo de indivíduos com atraso do desenvolvimento neuropsicomotor e autismo.
De que forma o exame é interpretado
Em ensaios envolvendo microarrays, a interpretação dependerá do tipo de metodologia empregada. Em linhas gerais, a luz emitida dependerá dos fluoróforos presentes nos alvos que ligaram-se às sondas.
Nos ensaios de expressão gênica, por exemplo, podem ser utilizados dois grupos de mRNA (cDNA): um obtido de células tratadas com medicamento X (marcado com fluoróforo vermelho) e outro de células controle (marcado com fluoróforo verde) .
Enquanto isso, na placa haverão sondas específicas para os genes aos quais deseja-se investigar a expressão.
Caso a célula tratada expresse determinado gene em quantidades muito maiores do que a célula controle, a luz emitida será vermelha, o que será captado e fotografado pelo equipamento.
Por outro lado, se ambas as células expressarem o gene em proporções semelhantes, uma mistura das cores (resultando no amarelo) será exibida.
Ainda, é possível que a célula controle expresse mais (ou exclusivamente) deste determinado gene, o que será traduzido na captação de luz verde pelo equipamento; ou que nenhum dos materiais genéticos empregados no ensaio encontrem uma sonda equivalente na placa, resultando na ausência da emissão de luz.
Nos ensaios de CGH/SNP-Array, a presença de CNVs poderá ser demonstrada da seguinte maneira: quando as sondas, o DNA-teste (marcado em verde) e o DNA-referência (marcado em vermelho) tiverem o mesmo tamanho, haverá emissão conjunta de luz, que resultará na cor amarela.
Quando houver uma deleção no DNA-teste, por outro lado, o DNA-referência irá hibridizar mais com a sonda, gerando a emissão de luz vermelha; quando houver uma duplicação, o DNA-teste irá hibridizar mais com a sonda, gerando a emissão de luz verde.
É importante ressaltar, por fim, que as análises por microarray são semi-quantitativas, a depender da resolução óptica do scanner empregado na análise. Além disso, a interpretação dos dados é realizada, ultimamente, após extenso processamento computacional.
Dessa forma, o analista não analisa os pontos de luz, mas informações previamente trabalhadas pelo computador.
Conclusão
Microarrays são superfícies sólidas com sondas (sequências de DNA) fixadas a elas. Em função de seu pequeno tamanho, um único ensaio envolvendo microarrays pode ter centenas de milhares de sondas.
Quando o material genético marcado fluorescentemente (alvo) é depositado sobre estas sondas, ocorre a hibridização entre eles. Com isso, é possível utilizar scanners próprios para este fim, que excitam os fluoróforos a fim de os fazer emitir luz. Este sinal é captado pelo equipamento e traduzido em informações objetivas para o analista.
Diferentes metodologias podem ser executadas utilizando microarrays como base. CGH/SNP-Arrays, por exemplo, têm vasta aplicação clínica, sendo utilizados na detecção de CNVs e de Polimorfismos de Nucleotídeo Único, o que pode substanciar diagnósticos e tratamentos personalizados com farmacogenômica.
Atualmente esta é a metodologia de escolha na investigação de transtornos do espectro autista e de anomalias congênitas não reconhecíveis clinicamente.
